พันธุศาสตร์ การวิจัยระดับโมเลกุลพื้นฐานจำเป็น ได้รวบรวมข้อมูลจากหนังสือ ตำรา และบทความต่าง ๆ รวมทั้งจากประสบการณ์การทำวิจัยทาง ด้านเทคโนโลยีชีวภาพพืชสมัยใหม่ของผู้เรียบเรียงเองเพื่อนำเสนอความรู้และเทคนิคพื้นฐานทางพันธุศาสตร์ ระดับโมเลกุลที่จำเป็นสำหรับผู้ที่จะเริ่มต้นศึกษาวิจัยทางด้านเทคโนโลยีชีวภาพระดับโมเลกุลของพืชโดยแบ่ง เนื้อหาเป็น 2 ส่วนหลัก ส่วนแรกเป็นความรู้พื้นฐานเกี่ยวกับกรดนิวคลีอิค จีโนม ยีนและกลไกการทำงาน ของยีน และส่วนที่สองเป็นหลักการเทคนิคระดับโมเลกุลพื้นฐานที่จำเป็นในการทำงานวิจัยระดับโมเลกุล ของพืช
การเข้าใจในหลักการของแต่ละเทคนิคเป็นอย่างดีจะช่วยให้ผู้วิจัยสามารถประยุกต์และดัดแปลงวิธีการ และขั้นตอนได้อย่างเหมาะสมเมื่อประสบกับปัญหาในการทำวิจัย และช่วยให้มีโอกาสประสบความสำเร็จในการ ทดลองมากขึ้น ปัจจุบันนี้มีการพัฒนาสื่อออนไลน์ทั้งภาพนิ่ง และภาพเคลื่อนไหวเกี่ยวกับพันธุศาสตร์ระดับ โมเลกุลจำนวนมาก ทั้งแสดงกลไกต่าง ๆ ภายในเซลล์สิ่งมีชีวิตและเทคโนโลยีหรือเทคนิคที่ใช้ในการทำวิจัย ซึ่ง ช่วยให้สามารถเข้าใจและเห็นภาพได้ชัดเจนมากขึ้น การใช้หนังสือเล่มนี้ประกอบกับการเรียนรู้จากสื่อเหล่านี้จะ ช่วยให้ผู้อ่านเกิดความเข้าใจได้ดียิ่งขึ้น
บทที่ 1 กรดนิวคลีอิค ยีน และจีโนม
กรดนิวคลีอิค (nucleic acid) เป็นชีวโมเลกุล (biological molecule) ขนาดใหญ่ในกลุ่ม แมคโครโมเลกุล (macromolecule) ที่อยู่ในรูปสายพอลิเมอร์ (polymer) ทําหน้าที่เก็บและถ่ายทอด ข้อมูลทางพันธุกรรม (genetic information) กรดนิวคลีอิคของสิ่งมีชีวิตมี 2 ชนิด ได้แก่ ดีเอ็นเอ (DNA ย่อมาจาก deoxyribonucleic acid) และอาร์เอ็นเอ (RNA ย่อมาจาก ribonucleic acid) กลไก ชีวเคมีต่าง ๆ ของสิ่งมีชีวิตอาศัยเอ็นไซม์ (enzyme) ซึ่งสร้างมาจากรหัสที่อยู่ในโมเลกุลดีเอ็นเอ ในจีโนม (genome) ของเซลล์ดีเอ็นเอ ส่วนที่มีรหัสอยู่นี้คือ ยีน (gene) ในกระบวนการถอดรหัส (transcription) ของยีนลําดับนิวคลีโอไทด์ของดีเอ็นเอทําหน้าที่เป็นแม่แบบ (DNA template) สําหรับการสังเคราะห์อาร์เอ็นเอ อาร์เอ็นเอที่ถอดรหัสมาจากยีน เรียกว่า อาร์เอ็นเอนํารหัส (messenger RNA) หรือ เอ็มอาร์เอ็นเอ (mRNA) ซึ่งจะถูกแปลรหัสไปเป็นลําดับของกรดอะมิโน (amino acid) เพื่อสร้างเป็นโปรตีนหนึ่งชนิดหรือมากกว่าหนึ่งชนิดผ่านกระบวนการแปลรหัส (translation) นําไปสู่การกําหนดลักษณะฟีโนไทป์ (phenotype) ของสิ่งมีชีวิตต่าง ๆ
บทที่ 2 แกนหลักของชีววิทยาระดับโมเลกุล
เซลล์สิ่งมีชีวิตเกือบทุกชนิดเก็บข้อมูลทางพันธุกรรมในรูปของดีเอ็นเอสายคู่ (double-stranded DNA) ยกเว้นไวรัส (virus) ซึ่งอาจมีจีโนมประกอบด้วยกรดนิวคลีอิคสายคู่หรือ สายเดี่ยว กรดนิวคลีอิคของไวรัสอาจเป็นดีเอ็นเอหรืออาร์เอ็นเอ โดยทั่วไปจีโนมของไวรัส มีขนาดเล็ก และสร้างโปรตีนเพียงไม่กี่ชนิดที่จําเป็นในการเพิ่มจํานวนของไวรัส ในการจําลอง และเพิ่ม จํานวนกรดนิวคลีอิคของไวรัส ไวรัสอาศัยกลไกทางชีวเคมีของเซลล์เจ้าบ้าน (host cell) ที่อาศัยอยู่ เช่น เมื่อไวรัสที่มีจีโนมเป็นอาร์เอ็นเอทําให้เซลล์ติดเชื้อแล้วระบบปฏิบัติการภายในเซลล์สามารถ แปลรหัสจากอาร์เอ็นเอของไวรัสไปเป็นโปรตีนได้โดยตรง หรืออาจใช้จีโนมของไวรัสเป็นแม่แบบแล้ว สังเคราะห์อาร์เอ็นเอคู่สม (complementary RNA) สําหรับการแปลรหัสต่อไป ไวรัสที่มีจีโนม เป็นอาร์เอ็นเอบางชนิดจะสร้างเอ็นไซม์รีเวิร์สทรานสคริปเทส (reverse transcriptase) เพื่อใช้ สังเคราะห์ดีเอ็นเอโดยใช้อาร์เอ็นเอเป็นแม่แบบ ทันทีที่เอ็นไซม์นี้กระตุ้นการถอดรหัสแบบย้อนกลับ (reverse transcription) จากอาร์เอ็นเอจีโนมของไวรัส ไปเป็นดีเอ็นเอคู่สมหรือคอมพลีเมนแทรี ดีเอ็นเอ (complementary DNA) หรือเรียกโดยย่อว่าซีดีเอ็นเอ (cDNA) กลไกการถอดรหัส และ การแปลรหัสของเซลล์เจ้าบ้านจะสร้างองค์ประกอบอื่น ๆ ที่จําเป็นต่อการเพิ่มจํานวนของไวรัส การไหลเวียนของข้อมูลทางพันธุกรรมของสิ่งมีชีวิตตามแกนหลักของชีววิทยาระดับโมเลกุล (central dogma of molecular biology)
บทที่ 3 การสกัดแยกกรดนิวคลีอิคของพืช
งานวิจัยด้านเทคโนโลยีชีวภาพสมัยใหม่ซึ่งเน้นพันธุศาสตร์ระดับโมเลกุลจําเป็นต้องใช้ กรดนิวคลีอิคจากตัวอย่างสิ่งมีชีวิตเพื่อใช้เริ่มต้นในการศึกษาวิจัย การสกัดแยกกรดนิวคลีอิค เป็น เทคนิคพื้นฐานจําเป็นสําหรับการทํางานวิจัยด้านนี้ กรดนิวคลีอิคมี 2 ชนิด ได้แก่ ดีเอ็นเอ (DNA) และ อาร์เอ็นเอ (RNA) ซึ่งมีโครงสร้างทางเคมีที่ใกล้เคียงกันมากดังนั้นการสกัดแยก กรดนิวคลีอิคทั้งสองชนิดจึงต้องมีวิธีการที่จําเพาะเพื่อแยกดีเอ็นเอและอาร์เอ็นเอออกจากกันรวมทั้ง ต้องแยกให้บริสุทธิ์จากชีวโมเลกุลอื่น ๆ ด้วย การใช้ดีเอ็นเอ และอาร์เอ็นเอที่มีคุณภาพดีช่วยทําให้ ผลการทดลองที่ได้มีความถูกต้องแม่นยําและมีความน่าเชื่อถือสูง รวมทั้งสามารถทําซ้ําได้
บทที่ 4 หลักพีซีอาร์พื้นฐาน
พอลิเมอเรสเชนรีแอ็คชั่น (Polymerase Chain Reaction) หรือพีซีอาร์ (PCR) เป็นเทคนิค การเพิ่มปริมาณชิ้นส่วนดีเอ็นเอที่สนใจในหลอดทดลองเทคนิคนี้ถูกพัฒนาขึ้น โดย Kary Mullis ในปี ค.ศ. 1983 และในปัจจุบันถือเป็นเครื่องมือพื้นฐานจําเป็นสําหรับงานวิจัยทางด้านชีววิทยาระดับ โมเลกุลในแขนงต่าง ๆ ของวิทยาศาสตร์สิ่งมีชีวิต (life sciences) ทั้งคน สัตว์ พืช และจุลินทรีย์ นอกจากนี้ยังมีการประยุกต์ใช้เทคนิคพีซีอาร์ในงานทางคลินิกด้วย พีซีอาร์สามารถเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอ เป้าหมายได้แม้ว่าจะมีดีเอ็นเอเป้าหมายเริ่มต้นเพียงหนึ่งโมเลกุล ดังนั้น ดีเอ็นเอจากแหล่งใดก็ตามที่มี ดีเอ็นเอเป้าหมายเพียงหนึ่งหรือไม่กี่โมเลกุลโดยหลักการสามารถใช้เป็นต้นแบบสําหรับการสําเนาเพิ่ม จํานวนด้วยเทคนิคพีซีอาร์ ทั้งนี้ไม่ว่าดีเอ็นเอจะมาจากแหล่งใดก็ตาม เช่น ดีเอ็นเอที่เตรียมได้จากเลือด สเปิร์มหรือเนื้อเยื่ออื่น ๆ จากตัวอย่างทางอาชญากรรม จากตัวอย่างสิ่งมีชีวิตโบราณ ดีเอ็นเอจาก จุลินทรีย์ในห้องปฏิบัติการ หรือดีเอ็นเอบริสุทธิ์ การทําพีซีอาร์พื้นฐานสามารถทําได้ก็ต่อเมื่อรู้ ข้อมูลลําดับนิวคลีโอไทด์ของดีเอ็นเอเป้าหมายเท่านั้น
บทที่ 5 ดีเอ็นเอโคลนนิ่ง
เดิมทีการวิเคราะห์รายละเอียดระดับโมเลกุลของโปรตีนหรือองค์ประกอบอื่น ๆ ในเซลล์ของสิ่งมีชีวิตทําได้ยากหรือแทบจะเป็นไปไม่ได้เลย เนื่องจากมีโปรตีนและองค์ประกอบเหล่านั้น ไม่เพียงพอที่จะนํามาวิเคราะห์ได้รวมทั้งการแยกบริสุทธิ์ให้ได้ปริมาณมาก ๆ ทําได้ยาก วิธีหนึ่งที่ทําได้ คือ การแยกสกัดยีนที่สร้างโปรตีนหรือผลผลิตที่สนใจออกมา อย่างไรก็ตาม จีโนมของสิ่งมีชีวิตทุกชนิด มีขนาดใหญ่และซับซ้อน และลําดับดีเอ็นเอที่เราสนใจส่วนใหญ่ปรากฏเพียงแค่หนึ่งหรือสองแห่ง ในเซลล์ดังนั้นวิธีทางเคมีหรือชีวเคมีไม่สามารถใช้แยกบริเวณที่จําเพาะของจีโนมเพื่อทําการศึกษา เฉพาะลําดับดีเอ็นเอที่สนใจได้เนื่องจากมีคุณสมบัติทางเคมีเหมือนกับลําดับดีเอ็นเออื่น ๆ การแก้ไข ปัญหานี้ทําได้โดยการนําชิ้นส่วนสั้น ๆ ของจีโนมซึ่งอาจมียีนหรือลําดับดีเอ็นเอที่สนใจใส่ไปในเวกเตอร์ (vector) เกิดเป็นรีคอมบิแนนท์ดีเอ็นเอ (recombinant DNA) ซึ่งสามารถจําลองตัวได้อย่างเป็นอิสระ จากจีโนม และโดยปกติจะจําลองตัวในเจ้าบ้าน (host) ชนิดอื่นได้ด้วย การเพิ่มจํานวนเซลล์เจ้าบ้านที่มี รีคอมบิแนนท์ดีเอ็นเออยู่ทําให้เกิดกลุ่มของสิ่งมีชีวิตที่มีความเหมือนกันทางพันธุกรรมหรือโคลน (clone) เรียกกระบวนการนี้ว่า ดีเอ็นเอโคลนนิ่ง (DNA cloning)
บทที่ 6 เทคนิคพันธุวิศวกรรมพืชเบื้องต้น
การถ่ายดีเอ็นเอสู่พืช (plant transformation) ได้ถูกนํามาใช้สําหรับศึกษากลไก การทํางานของพืชและเพื่อใช้ในการปรับปรุงคุณลักษณะของพืชปลูก โดยการถ่ายดีเอ็นเอสู่พืชมุ่งหวัง ที่จะถ่ายดีเอ็นเอเข้าไปรวมอยู่กับจีโนมของพืชอย่างถาวร ทั้งนี้มีการพัฒนาเทคนิคการถ่ายดีเอ็นเอ สู่พืชหลายวิธีและประสบความสําเร็จในพืชหลายชนิดแล้ว การถ่ายดีเอ็นเอสู่พืชที่นิยมวิธีหนึ่ง คือ การใช้อะโกรแบคทีเรียม (Agrobacterium) ซึ่งเป็นเชื้อก่อโรคในพืชใบเลี้ยงคู่ช่วยถ่ายดีเอ็นเอ เข้าสู่จีโนมของพืช ในระยะเริ่มแรกของการถ่ายดีเอ็นเอเข้าสู่พืชโดยใช้เชื้ออะโกรแบคทีเรียม ไม่ประสบความสําเร็จในการถ่ายดีเอ็นเอสู่พืชใบเลี้ยงเดี่ยว ทําให้มีการพัฒนาวิธีการถ่ายดีเอ็นเอ โดยตรงโดยไม่ผ่านอะโกรแบคทีเรียม วิธีการถ่ายดีเอ็นเอโดยตรงที่นิยมและประสบความสําเร็จมาก คือ การยิงอนุภาค (particle bombardment หรือ biolistics) วิธีนี้ถูกนํามาใช้ในการถ่ายดีเอ็นเอ สู่พืชใบเลี้ยงเดี่ยวอย่างกว้างขวาง อย่างไรก็ตามปัจจุบันมีการพัฒนาสายพันธุ์อะโกรแบคทีเรียม ให้สามารถถ่ายดีเอ็นเอเข้าสู่พืชใบเลี้ยงเดี่ยวได้อย่างมีประสิทธิภาพเช่นกัน
บทที่ 7 การตรวจสอบการแสดงออกของยีน
แม้ว่าทุกเซลล์ของสิ่งมีชีวิตแต่ละชนิดจะมีชุดของยีนเหมือนกัน แต่ไม่ใช่ทุกยีนที่จะถูกใช้ พร้อมกันในทุกเซลล์ทุกเวลา มียีนเพียงบางส่วนเท่านั้นที่ถูกใช้ในเซลล์หนึ่ง ณ ช่วงเวลาหนึ่งผ่านการ ควบคุมเป็นอย่างดีในรูปแบบการแสดงออกของยีน (gene expression) ที่ทําให้เซลล์ในแต่ละเนื้อเยื่อ หรืออวัยวะมีความแตกต่างกัน รวมทั้งตอบสนองต่อสิ่งกระตุ้นแตกต่างกันไป การแสดงออกของยีน ส่วนใหญ่เป็นพลวัตคือมีการเปลี่ยนแปลงอยู่เสมอ ยีนเดียวกันอาจแสดงออกแตกต่างกันได้ในสภาวะ แวดล้อมที่ต่างกันหรือเมื่อถูกกระตุ้นด้วยสิ่งเร้าที่ต่างกัน พืชที่มีจีโนไทป์เหมือนกัน เช่น พืชที่มาจาก การขยายพันธุ์แบบไม่อาศัยเพศอาจมีฟีโนไทป์ต่างกันได้หากพืชได้รับสิ่งกระตุ้นที่แตกต่างกัน ความแตกต่างที่เกิดขึ้นนี้เกิดจากการที่ยีนมีการแสดงออกที่แตกต่างกัน
รองศาสตราจารย์ ดร. คำรพ รัตนสุต
ภาควิชาวิทยาศาสตร์การเกษตร
คณะเกษตรศาสตร์ ทรัพยากรธรรมชาติและสิ่งแวดล้อม
